Критерии безопасности применения аутологичных клеточных культур

30.05.2012

Безопасная клеточная терапия

Обобщение результатов многолетних исследований в области культивирования постнатальных человеческих клеточных линий, предназначенных для применения в клинике, позволило специалистам из Уральской ГМА разработать четырехэтапную схему отбора по критериям включения/исключения, направленную на безопасность клеточной терапии.

Схема отбора сформирована на основании: анамнестических данных и результатов врачебного осмотра, результатов лабораторных исследований, результатов исследования клеточных культур и результатов тестового введения клеток.

Одним из ключевых принципов обеспечения безопасности является непрерывность мониторинга. Он осуществляется на каждом этапе по определенным критериям.

При заборе материала - отбор пациентов по критериям исключения участников испытаний. К абсолютным критериям относятся острые и хронические заболевания в стадии обострения, в том числе сопровождающиеся тканевой дезорганизацией, а также аутоиммунные заболевания соединительной ткани (коллагенозы) и иммунодефицитные состояния.

К критериям исключения относится потенциальная инфицированность возбудителями социально-значимых заболеваний (ВИЧ, вирусные гепатиты В, С, цитомегаловирусная инфекция, туберкулез, инфекции, вызываемые Chlamydia spp.), присутствие которых устанавливается иммунофлюоресцентным и иммунополяризационным методами с использованием закрытых систем (AbbotLab) или ПЦР-анализа (с применением наборов Flash).

В ходе культивирования критерии мониторинга включают в себя определение вторичной контаминации микоплазмой, ДНК которой, по нашим данным, выявляляется в 16 % культур клеток кожи. Последнее относится к относительным критериям исключения, так как преодолевается двадцатикратным увеличением концентрации тилозина в культуральной среде.

К относительным критериям относится наличие IgG к цитомегаловирусу в сыворотке крови, выявляемое у 95 % испытуемых. Последнее свидетельствует о ранее перенесенной инфекции, так как специфических антител IgM к цитомегаловирусу в сыворотке крови испытуемых найдено не было ни в одном случае.

Важной составляющей мониторинга является оценка неоплазии в культурах. В наших исследованиях для анализа мутаций используется ДНК, выделенная из культивируемых клеток, культуральной жидкости и - с целью подтверждения неогенеза - из крови испытуемых.

Применения аутологичных клеточных культур

Исследуются мутации в генах р53 кодон 175 (1 мутация), кодон 248 (3 мутации), кодон 273 (4 мутации), B-raf (2 мутации), K-ras (2 мутации).

Основные этапы ДНК-анализа

ДНК-анализ включает 3 основных этапа:

скрининг на наличие изменения структуры экзонов генов-супрессоров опухолевого роста и протоонкогенов с использованием SSCP-анализа;
уточнение структурных изменений в экзонах посредством аллель-специфичной ПЦР и рестрикционного анализа экзонов;
верифицикация типа и положения мутации, а также количества мутантных аллелей в образце в ходе RT-ПЦР.

В 152 исследованных краткосрочных культурах аутогенных фибробластов неогенез мутаций in vitro был подтвержден. Так, в клетках одной из культур, полученной из кожи испытуемой Н., была выявлена мутация в 248 кодоне гена р53 (G248C), получившая подтверждение в процессе выполнения всех этапов определения мутантных генов.

Мутация была выявлена в клетках одной из культур испытуемой Н. после 3-го пассажа клеток. Однако в других параллельных культурах испытуемой, а также в образцах ее периферической крови мутации в гене р53 не найдено, что послужило основанием для выбраковки единичной культуры, содержащей мутантную ДНК.

Полученные результаты хорошо согласуются с проведенными за рубежом исследованиями, подтверждающими наличие элементов генетической нестабильности при длительном культивировании клеточных линий, а единичный положительный результат может свидетельствовать о том, что при сроках культивирования до 30 суток зарегистрированное генетическое событие является сравнительно редким.

Критерием исключения пригодных для трансплантации культур оказалась также протеиназная активность, в частности высокий уровень интерстициальной металлопротеиназы-1, способной инициировать фибробласт-опосредованную деградацию соединительной ткани с развитием трансплантационных осложнений в виде местной воспалительной реакции.

Четырехэтапная схема успешно апробирована у 48 испытуемых и может рассматриваться как основа обеспечения безопасности клеточной терапии.

Ссылки по теме:

Автор материала Елена Васильева, врач общей практики специально для Spinet.ru

Все новости

Также стоит почитать:

Последние темы в форуме:

Антеспондилолистез тела l5. Грыжа l5-s1

Рецепт на катадолон

Остеохондроз. Ретролистез. Антелистез

Гемангиома позвонка Тh3

Помогите разобраться протрузия l5-s1

остеохондроз