Spinet.ru - Остеохондроз, здоровье позвоночника
 
Почта
Добавить в избранное Медицинский форум Медицинская социальная сеть На главную

Информация

 
 
 
Строение, заболевания и лечение суставов
 
Строение позвоночника
 
Влияние компьютера на здоровье человека
 
Диагностика заболеваний опорно-двигательного аппарата
 
Методы лечения болей в спине при остеохондрозе и грыжах межпозвонковых дисков
 
Операции на позвоночнике при грыже межпозвонкового диска
 
Обзор медицинских исследований о лечении болей в спине
 
Научные данные и обзоры медицинских исследований о болях в суставах
 
Экология и ее влияние на здоровье человека
 
 
 
 

Сервисы

 
Медицинский форум
 
Опросы о болях в спине и способах их лечения
 
Медицинский дневник самочувствия
 
Медицинские выставки
 

Календарь событий

 
 
 
 
 

Ваше мнение о странице:
Для того, чтобы проголосовать за тему, вам необходимо авторизироваться или зарегистрироваться
 
 
реклама

Аномалии скелета как результат инсерционного мутагенеза в эмбриональных стволовых клетках мыши

 

Генетическая модификация эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), последующее конструирование первичных (эмбриональных) химер и получение фаундеров, происходящих из ЭСК, - одна из самых современных технологий получения животных желаемого генотипа (трансгенных животных). Именно этот подход сделал возможным разработку многочисленных биологических моделей болезней человека через создание генетически трансформированных линий лабораторных животных. Известно, что при использо­вании для трансгенеза в качестве вектора «голой» ДНК (naked DNA) зачастую происходит встройка не еди­ничной копии вводимой конструкции, а тандемного повтора, состоящего из 2-1000 копий. Место встройки в этом случае непредсказуемо. Поэтому важными характеристиками трансгенной линии животных являются копийность трансгена и его локализация. Нередко генетическая трансформация негомологичными вектора­ми сопровождается случайным нокаутом какого-либо гена из-за инсерции конструкции в его кодирующую или промоторную часть. Как следствие, происходит замолкание поврежденного гена, что может иметь и фенотипическое проявление.

В данном сообщении от исследователей из Института цитологии и генетики СО РАН представлено исследование ряда эффектов, наблюдаемых у трансгенных мышей. Эти эффекты проявляются на уровне целостного организма и связаны, вероятно, с особенностями локализа­ции трансформирующего вектора в геноме ЭСК.

Линия ЭСК MA01 была получена из 3,5-дневных бластоцист аутбредных гибридов мышей линий 129 и BALB (линия 1В). ЭСК были трансформированы плазмидой pEGFP-N1, кодирующей флуорохром EGFP. Цель трансформации - генетическая маркировка потомков ЭСК посредством введения гена, кодирующего EGFP под конституитивным промотором. Дальнейший кариологический анализ показал, что один из субклонов ЭСК MA01-3E имеет нормальный диплоидный кариотип XY, что и определило выбор этого субклона для кон­струкции первичных химер.

Методом введения группы ЭСК в полость бластоцисты мышей линий C57BL было получено 6 химер (4 самки и 2 самца). Среди химер 3 особи не достигли возраста репродуктивной зрелости, а для фертильных химер (1 самец и 2 самки) GLT-тест был проведен направленным скрещиванием на обе родительские линии мышей - C57BL и 1В. В этих скрещиваниях было получено 210 потомков, из которых 2 имели вклад генотипа MA01-3E. Генотипирование на трансгенный EGFP подтвердило наличие введенного вектора у одного из них.

В скрещивании основного фаундера с гибридными самками F1 (9129 х d"C57BL) было получено 15 по­томков, для которых подтверждено присутствие трансгена в гетерозиготном состоянии. Из них 2 особи име­ли видимые аномалии в строении осевого скелета и пояса задних конечностей. В скрещивании основного фаундера с самками линии 129 было получено 5 гетерозиготных потомков (2 самца и 3 самки) без видимых аномалий. Однако при постановке скрещиваний этих гетерозигот друг на друга было получено как минимум 20 дефектных особей. Дефект выражался в искривлении позвоночника, укорочении и искривлении хвоста, уменьшении, укорочении и искривлении бедра, голени, стоп. Наблюдали существенное ограничение степеней свободы во всех суставах задних конечностей. Указанные аномалии с высокой частотой сопровождались полидактилией и синдактилией на задних конечностях, симметрично. Степень выраженности аномалий ва­рьировала от животного к животному, в наиболее тяжелых случаях дефекты скелета сопровождались кар­ликовостью и сильными нарушениями двигательного паттерна. У таких животных уменьшалась продолжи­тельность жизни (до 1,5-2 мес.), размножения не происходило. Корреляция проявления эффекта с полом животного требует дальнейшего уточнения.

Для характеристики трансгенного локуса у потомков основного фаундера (нормальных и дефектных) были определены копийность и сайт интеграции трансгенной конструкции. Для определения копийности трансгена использовали метод количественной ПЦР (qPCR). Проведенный анализ показал, что трансген пред­ставляет собой тандем из 5 копий генетической конструкции. Для определения сайта интеграции трансгена использовали метод TAIL-PCR, так как он является одним из наиболее простых и надежных способов локали­зации трансгена. Было показано, что инсерция трансгена произошла в первый интрон гена Trim71. Из имею­щихся в литературе данных следует, что Trim71 активен в эмбриональный период и связан с формированием нервной трубки.

Таким образом, показано, что изменения фенотипа в данном случае связаны с присутствием трансгена в геноме мышей-потомков, поскольку аномалии осевого скелета и конечностей наблюдались только у гетеро- и гомозигот в двух независимых направлениях скрещивания. Мы предполагаем, что изменения фенотипа могут быть вызваны инсерцией трансгена (или части трансгена) в область гена Trim71. Влияние копийности трансгена на проявление эффекта требует дальнейшего исследования.






Понравилась статья? Поделись с друзьями!



Также стоит почитать:





Реклама:
Медицинские центры, врачи


Опросы, голосования

    Загрузка...