Выделение, культивирование и исследование остеогенного дифференцировочного потенциала клеток костного мозга мышей

Показано, что мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга способны дифференцироваться в остеогенном направлении, в связи с этим такие клетки можно использовать для восстановления поврежденной костной ткани. Перед реализацией остеорегенеративного потенциала этих клеток необходимо разработать протоколы их выделения, культивирования и индукции остеогенной дифференцировки в системе in vitro.

Цель исследования сотрудников ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мышей линии Black, отработка условий культивирования и криоконсервации полученной культуры, исследование остеогенного дифференцировочного потенциала.

Клетки выделяли из костного мозга, полученного из бедренных и большеберцовых костей мышей линии Black. Костный мозг подвергали механической дезагрегации до формирования клеточной суспензии. Выделение мононуклеарной клеточной фракции проводили с использованием высокой адгезивной способности мезенхимальных стволовых клеток, удаляя неадгезировавшую клеточную фракцию на третьи сутки культивирования.

В течение 5-14 сут культивирования в термостате при 37 °С в атмосфере 5 % СО₂ наблюдали рост кле­ток в виде колоний с последующим формированием монослоя клеток, характеризующихся гетерогенностью популяции. При этом фибробластоподобные клетки составляют 30-80 %. Необходимо отметить, что клетки культивировали в стандартных условиях селективного культивирования МСК: питательная среда Игла МЕМ с 10 % сыворотки крови плодов коровы. Криоконсервацию клеток проводили в этой же среде с добавлением 10 % глицерина, хранили при температуре -196 °С в жидком азоте. Посевная концентрация (1,0-2,0) х 10⁶ клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2, клетки пересевали через 7-10 сут. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 % раствор трипсина и раствор версена в соотношении 1:2.

Направленную дифференцировку ММСК в остеогенном направлении осуществляли путем добавления индукторов дифференцировки (дексаметазона, бета-глицерол-2-фосфата и L-аскорбиновой кислоты) в ростовую питательную среду. Специфичность остеогенной дифференцировки подтверждали по накоплению минерализованных компонентов матрикса. Идентификацию кальциевых депозитов осуществляли путем гистохимического выявления солей кальция в культурах ализариновым красным S.

Из костного мозга получена культура клеток с высоким пролиферативным потенциалом. При культивировании в остеоиндуктивной среде МСК-КМ дифференцировались в соответствующем направ­
лении. Остеогенную дифференцировку проследить визуально было затруднительно. Отмечено постепенное изменение морфологических особенностей клеток, они приобретали более округлую форму, внутри клеток появлялись специфические отложения кальциевых депозитов, выявляющиеся при последующем специфиче­ском окрашивании.

В ходе работы выделены и культивированы клетки, которые по своим свойствам были по­добны мезенхимальным стромальным клеткам. Показана способность культивируемых ММСК к дифференцировке в остеогенном направлении.

Автор материала Елена Васильева, врач общей практики специально для Spinet.ru

Также стоит почитать: