Влияние цитокинов TNM-a и GM-GCF на экспрессию остеокласт-специфичных генов в культуре клеток моноцитов человека

Остеопороз занимает четвертое место в мире среди всех неинфекционных болезней как при­чина инвалидности и смертности, что определяется такими его последствиями, как переломы позвонков и ко­стей периферического скелета. Несмотря на важность данной проблемы, лечение больных с остеопорозом разработано не в полной мере и не отвечает требованиям таргетной терапии заболеваний. Шаг вперед в области разработки лекарственных препаратов может быть сделан с помощью клеточных фармакологических моделей, в том числе с использованием культур остеокластов и их предшественников.

Группа проостеокластогенных факторов представляет интерес в связи с возможностью ее использова­ния для индукции остеокластогенеза в моноцитарных клетках-предшественницах и получения культур осте- окластоподобных клеток в условиях in vitro. Помимо классических стимуляторов остеокластогенеза, таких, как RANKL (receptor activator of NF-kB ligand - лиганд рецептора активатора NF-kB) и M-CSF (macrophage
colony-stimulating factor - макрофагальный колониестимулирующий фактор), особо выделяются TNF-a (tumor necrosis factor alpha - фактор некроза опухолей альфа) и GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), по поводу роли которого в фор­мировании остеокластов в литературе не сложилось единого мнения.

Цель исследования учёных из Новосибирского НИИТО: изучение влияния цитокинов TNF-a и GM-CSF на экспрессию некоторых остео­класт-специфичных генов в культуре клеток моноцитарной линии человека U-937.

В исследовании применяли методы культуральной работы с перевивае­мой моноцитарной клеточной линией человека U-937. Для стимуляции дифференцировки использо­вали TNF-a (10 ng/ml) и GM-CSF (50 ng/ml). Для оценки уровня экспрессии остеокласт-специфичных генов и результатов дифференцировки выбранной линии клеток применяли современные молекуляр- но-биологические методики: методы выделения мРНК и синтеза кДНК с использованием наборов «RNeasy Mini Kit» («Qigen») и «iScript cDNA Synthesis Kit» («Bio-Rad Laboratories»), полимеразная цепная реак­ция в режиме реального времени на приборе «CFX 96™ Real-Time PCR Detection Systems» с использовани­ем интеркалирующего флуоресцентного агента SYBR Green. Все эксперименты проводили в тройных не­зависимых повторах, полученные средние значения данных использовали для определения кратности изменения экспрессии остеокласт-специфических генов по формуле, предложенной Livak и Schmittgen: Relative fold = EtargetACttarget/Ereference actinACtactin, где AC(t) = Сфконтр - Сфобработанных клеток; Е - эффективность амплификации гена.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью электронных таблиц программы «Microsoft Exсel 2007». Результаты представлены как среднее значение и стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при Р < 0,05.

Результаты. Выбрана панель генов-маркеров остеокластов Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), Calcitonin receptor (CALCR), Cathepsin K (CTSK), Osteoclast-associated receptor (OSCAR), d2isoform of vacuolar ATPase V0dOmain (ATP6V0D2), Matrix metallOprOteinase-9 (MMP9), ReceptOr activatOr Of NF-kB (TNFRSF11A), VitrOnectin receptOr (ITGAV), MicrOphthalmia-assOciated transcriptiOn factOr (MITF), Nuclear factor kB (NFKB1), Nuclear factOr Of activated T cells c1 (NFATc1) и праймеров для определения экспрессии их мРНК, дана харак­теристика клеточной линии U-937, а также проанализирована экспрессия целевых генов в клеточной линии U-937 после стимуляции в соответствии с разработанными протоколами.

Выводы

1. Впервые исследована экспрессия одиннадцати генов, участвующих в остеокластогенезе, по определению уровня их мРНК методом Real-Time PCR в культуре клеток моноцитарной линии человека U-937 (TRAP, CALCR, CTSK, OSCAR, ATP6v0d2, MMP9, RANK, ITGAV, MITF, NF-kB, NFAT1c).
2. Показано, что в культуре клеток моноцитарной линии человека U-937 после стимуляции TNF-a и комбинацией TNF-a с GM-CSF отмечается снижение содержания мРНК генов, кодирующих транскрипционные факторы (NF-kB, MITF, NFAT1c), остеокласт-специфические рецепторы (TNFSR11A, CALCR, ITGAV, OSCAR) и ферменты остеокластов (MMP9, TRAP, CTSK, ATP6v0d2).

Автор материала Елена Васильева, врач общей практики специально для Spinet.ru

Также стоит почитать: